北京总部
电话:010-51581369
上海办事处
电话:13917930412
广州办事处
电话:18911603738
青岛办事处
电话:18669721765
天津办事处
电话:18920376175
武汉办事处
电话:13476191662
成都办事处
电话:17313116388
南京办事处
电话:13641800054
西安办事处
电话:13201540808
石家庄办事处
电话:13693073503
合肥办事处
电话:18905696823
杭州办事处
电话:18106759709
重庆办事处
电话:15340558405
首先,需要了解WB的基本原理,利用电泳分离蛋白质,接着将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测,通过分析条带大小和显色信号获得目标蛋白质在所分析的细胞或组织样本表达情况的信息。
既然是获取目标蛋白的表达情况,那就需要一个参考蛋白,根据目标蛋白与参考蛋白比较来获得表达量的变化。
这又出现一个疑问,既然是获取目标蛋白的表达变化,只要WB实验结果出现目标蛋白和参考蛋白,就可以进行半定量。那为什么还需要进行蛋白浓度测定呢?
但是,我们再来看一下参考蛋白图,在Control中,S1的结果也偏低,造成这样的原因是电泳上样量偏少。虽然根据此结果也可以进行分析(Test S1 /Control S1 ),但是从图上看,是不是觉得图不漂亮,甚至让人觉得结果有误,有造假的可能。
所以进行WB实验,需要测定样品的蛋白浓度,主要目的是对样品进行均一化处理,使电泳各孔的蛋白上样量(质量 μg)一致,这样既能确保上样总量一致(利于总蛋白归一化),也能确保参考蛋白量一致(利于参考蛋白归一化);此外,电泳孔的载样量是有限的,一般 不超过100 μg ,上样量过大无法分离蛋白,并且在ECL显色还会出现过曝反白,上样量过低又无法检测到蛋白。
1、蛋白的测定方法分两大类:一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键 和紫外吸收等 测定蛋白质含量;另一类是利用蛋白质的氨基酸残基、酸性和碱性基团及芳香基团等测定蛋白质含量。测定依据:蛋白质浓度测定一般利用蛋白质以下的结构或性质。
上述的蛋白测量方法,受到方法灵敏度,操作复杂程度,测量时间以及设备限制等,目前实验室常用 5 种方法:BCA 法 ,Bradford 法 ,双缩脲法(Biuret 法),Folin 法(Lowry 法)和紫外分光光度计法。
BCA 法的原理是在碱性条件下,蛋白质将二价铜还原为一价铜,与 BCA 形成紫颜色的络合物,测定 562 nm 的 OD 值,所以如果样本里有还原剂(比如 DTT、β -巯基乙醇或TCEP )的话就会对 BCA法 的结果产生干扰。
Bradford 法(考马斯亮蓝法)是在酸性条件下,加入考马斯亮蓝 G250 与蛋白质(主要是碱性或芳香族氨基酸)结合为蓝色化合物,吸光度值从 465nm 变成 595 nm,最后测定 595 nm 的 OD 值来计算蛋白质浓度, Bradford受到高浓度去垢剂的干扰 。
双缩脲法或 Folin 法由于检测灵敏度不够高,已被 BCA法 或 Bradford 法所代替。
而紫外分光光度计法是利用氨基酸残基在 280 nm 处有吸收峰来定量,由于不同氨基酸吸收峰值略有不同,故在蛋白质成分单一的情况下使用效果佳,比如蛋白纯化后估测蛋白的浓度。
每个实验室都有各自的传承,在方法选择上各有所爱,但绝大部分实验室要么用 Bradford法要么用BCA法进行蛋白定量。
受螯合剂和还原剂的影响,需确认EDTA低于10mM,无EGTA,DTT低于1mM,β-巯基乙醇低于0.01%;
仅对标准 BCA 蛋白检测方案进行了轻微修改(与兼容性试剂进行 15 min 孵育);无需沉淀步骤。
地址:北京市海淀区北三环西路32号恒润中心1201 电话:010-51581369/82113221 传真: 爱游戏登录入口-游戏大厅app下载 备案/许可证编号为:京ICP备14000724号-25