NanoTemper是全球领先的科学仪器制造商，2008年成立于德国慕尼黑，历经十余载发展，在全球13个国家设立分支机构。NanoTemper公司作为生命科学领域的创新企业，一直致力于为药物筛选提供靶蛋白质量评估、高通量亲和力筛选等便捷的生物物理工具。

  其基于专利的微量热泳动技术（MST）和光谱位移技术（Spectral Shift）研发的Monolith分子互作仪，截止2022年，已发表的文献超过5000篇。以下筛选的案例涉及药物研发、神经退行性疾病，结构生物学、Protacs以及病毒研究等多个领域，希望对大家的实验项目有所启发和帮助。

  在这项工作中，作者先筛选了SARS-CoV-2 3CLpro，然后应用MST技术检测HIV/HCV蛋白酶的结合活力。作者发现26种蛋白酶中的9种以剂量依赖的方式有效地抑制SARS-CoV-2 3CLpro的活性，其中四种化合物在体外表现出与3CLpro结合的能力。

  综上，微量热泳动技术（MST）是一项非常好的可以检测蛋白与小分子间亲和力的技术。不基于质量改变的原理，可以很好的胜任不同分子量大小差异的互作，而且无需固定化操作，完全在溶液中进行检测。

  抗抑郁药物（AD）结合到靶点上进而产生临床抗抑郁效果的机制尚不清晰。赫尔辛基大学研究人员发现脑胆固醇（CHOL）可直接与神经营养酪氨酸激酶受体2 (TRKB) 跨膜域(TMD)结合，进而调节TRKB信号通路。此外，发现典型和快速作用的抗抑郁药直接结合到TRKB TMD二聚体形成的一个位点上，从而促进TRKB细胞表面表达，增强脑源性神经营养因子（BDNF）信号传导。该研究解决了关于抗抑郁药临床疗效的基础分子机制问题。

  在此研究中，作者使用MST技术检测TRKB与CHOL和ADs的结合。TRKB为跨膜蛋白，且分子量较大92kD，很难纯化。作者将GFP-TRKB质粒转染至HEK293T中过表达。进行互作亲和力检测时，直接将过表达GFP-TRKB的HEK293T细胞裂解后取上清。以GFP-TRKB融合蛋白作为荧光信号源，进行MST检测。

  向HEK293T细胞裂解液中加入梯度稀释的CHOL，通过MST技术检测到CHOL与GFP-TRKB的亲和力为~20μM。表明CHOL可直接与TRKB结合，突变TRKB 433位关键氨基酸破坏了TRKB与CHOL之间的相互作用。

  对于一些本身就难以纯化的蛋白，包括膜蛋白等，以及在缓冲液中无法得到真实的互作结果等情况，使用MST技术进行互作亲和力检测可以解决这些问题！在裂解液环境下甚至用全细胞进行亲和力检测！

  阿尔茨海默病成因较为复杂，目前尚无特别明确的机制。但是不光是阿尔茨海默病，几乎所有神经退行性疾病的标志，或者说关键过程都是蛋白聚集。

  Tau 蛋白是一种微管结合蛋白（MAP），此前的研究认为过度磷酸化的 Tau 会形成神经纤维缠结，也有研究指出锌离子的结合会加速 Tau 蛋白的纤维化进程（图1）。因此，表征锌离子与 Tau 之间的相互作用，有助于我们进一步理解疾病发生的分子机制。但由于 Tau 蛋白可能会发生聚集，并且锌离子的分子量非常低，如果仅通过分子量变化检测，极易受到背景信号的干扰而产生假阴性的结果。

  使用 MST 技术成功检测到了 Tau 蛋白与锌离子之间的相互作用。图 3 为典型的 MST 结合曲线，呈现为“S”形。图 4 为 Tau 蛋白与锌离子的结合曲线，可以明显看到红框中高浓度的锌离子并未达到饱和，而是出现了另一段信号变化。在加入 5mM 的 EDTA 螯合锌离子后所有的变化均消失。这表明 Tau 蛋白与锌离子有多个结合位点且亲和力不同。

  MST 技术不仅可以定量检测亲和力，还可通过原始曲线反馈溶液中样品是否存在聚集。如果 MST 曲线 所示的平滑曲线，则表明样品无聚集。如果 MST 曲线 中的 “跳动”，则表明样品存在聚集。

  从应用案例中可以看出，MST 技术检测速度快，无需担心样品在检测期间发生变化从而影响结果。检测灵敏度高，不仅仅依赖于单一指标，成功表征了蛋白聚集体与离子间的相互作用。

  结核病是由结核分枝杆菌感染引起的一类传染性疾病，目前结核病的流行依然十分广泛。伸长因子EF-Tu作为细菌内含量最为丰富的一类蛋白，不仅在蛋白质的翻译过程中发挥重要作用，而且有新的证据表明，EF-Tu可能是治疗结核分枝杆菌感染的一个重要靶点。2022年10月3日，复旦大学李继喜教授课题组与中科院植物生理生态研究所赵国屏院士团队合作在Communications Biology在线发表了研究成果“Structural insights of the elongation factor EF-Tu complexes in protein translation of Mycobacterium tuberculosis”。

  研究人员通过对Ef-Tu不同复合物的晶体学结构研究，发现结核杆菌来源的EF-Tu与EF-Ts之间具有不同的相互作用方式。接下来，研究人员通过nanoDSF技术对两千多种小分子进行筛选，得到与EF-Tu特异性结合的抑菌分子Osimertinib，并用MST技术验证了Osimertinib与EF-Tu的直接相互作用。同时，抑菌实验证明Osimertinib具备结核分枝杆菌无毒株H37Ra的菌株抑制能力。这项研究为抗结核药物的筛选提供了新的思路。

  应用案例同使用NanoTemper公司的蛋白稳定性分析仪的nanoDSF技术和MST分子互作技术，通过nanoDSF技术筛选出候选小分子，再通过MST技术验证靶点与分子之间的亲和力。为抗结核药物的筛选提供了新的思路。

  沈阳药科大学陈丽霞和李华团队在前期研究中从中药千金子中获得了一系列千金烷二萜类化合物，其中ZCY-001化合物具有最强的抗炎活性，并且具有低毒性。

  研究人员将该化合物的核心骨架Lathyrol（即千金子二萜醇）与沙利度胺 (E3连接酶CRBN配体) 通过PEG linker相连，得到了PROTAC分子ZCY-PROTAC。使用该PROTAC分子对细胞进行处理后提取蛋白，并使用TMT串联质谱标签进行标记定量蛋白组学分析（图1 A）。比较蛋白组学分析发现MAFF蛋白在ZCY-PROTAC处理后发生了最为显著的降解。Western Blot结果也显示, MAFF蛋白的降解水平与ZCY-PROTAC的剂量和作用时间是正相关的（图1 B）。

  为了验证比较蛋白组学发现的靶点蛋白，研究人员采用微量热泳动(MST）技术直接检测Lathyrol及其衍生物ZCY020与MAFF蛋白的结合能力。

  MST技术用于Protac药物的筛选，灵敏度高，检测范围广，而且在液体条件下进行检测，无需分子固定，可以保证二元复合物处于可控的平衡状态，固定的话会影响二元复合物的稳定性。

  在MST实验中，研究者使用纯化的NLRP6蛋白，定量检测其与不同类型的核酸分子(dsDNA/dsRNA/ssDNA/ssRNA)之间相互作用。结果表明，NLRP6优先结合dsRNA（Kd=1.2 μM）而非其他核酸。此外，MST结果还显示NLRP6与脂磷壁酸（LTA）存在相互作用。

  MST进行互作检测速度快，只需10min，在检测蛋白和核酸的互作时，可以有效避免因检测时间过长导致的核酸降解。

  MO 系列仪器采用微量热泳动（ MST）技术定量分析分子间相互作用。通常对互作分子中的一个分子进行荧光标记，使之成为非常灵敏的标签分子；与另一个分子结合形成复合物，较之标签分子，复合物分子的热泳动特性有所改变，因此很容易探测到由结合引起的MST 信号变化。最近新推出的Monolith X搭载的光谱位移技术保留了易于设置，溶液内直接检测分子间相互作用以及无最小样品的要求等众多优势，最快仅需1min即可精确检测分子间的kd值。实验结果通过软件自动分析，从而精确地计算Kd值。

  公司高度关注生命科学领域新技术发展，及时引进国外最新的技术和产品，本着客户至上的原则，为客户提供专业、全面优质的整体解决方案。公司目前产品涉及细胞生物学、药物筛选、肿瘤免疫、细胞治疗、抗体研发及组织工程等多个应用方向。

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