流式细胞术最初诞生于20世纪60年代末，发展之初主要应用于计数和评估颗粒的大小。随着硬件和软件的不断升级发展以及各种荧光试剂的迭代更新，流式细胞术作为一种能够对细胞群、细胞亚群及单个细胞或者颗粒进行多参数、快速的定性/定量的分析手段，已经被深入应用于细胞生物学、免疫学、病毒学、肿瘤生物学、传染病检测、食品和环境监控及生物制药等多个研究领域。

  流式细胞技术部门作为中国科学院分子细胞科学卓越创新中心细胞分析技术平台的一个重要分支，从成立最初的只有一台2激光4色流式细胞检测仪和2激光7色流式细胞分选仪发展至今已经具备了高低不同配置的流式细胞检测仪8台、流式细胞分选仪7台、高活性全自动磁珠分选仪1台（

  ），最大程度地满足中心及周边乃至全国科研院所在流式细胞仪方面的实验需求。平台流式的建设和发展与流式技术的不断更新、科研方向的转变是息息相关的。现就平台在流式方面的使用心得进行分享及对未来流式潜在的需求做一些展望。

  一、流式细胞检测传统流式细胞仪的硬件系统通常由一个或者多个激光器组成的光照系统、二向色镜以及带通/长通滤光片组成的分光光学器件、高灵敏度光电倍增管（PMT）或雪崩光电二极管组成的检测系统组成。传统流式细胞仪内一个激光器可以搭配2个或多个PMT通道，一个PMT对应一个检测通道，接收发射光谱的峰值信号。激光器越多检测通道越多，可检测荧光信号也越多。平台根据中心各课题组的实验需求配置了不同型号的基于传统检测原理的流式细胞检测设备。

  细胞内源荧光蛋白或自发荧光的检测主要包括三个方面的应用：1.细胞系转染质粒后阳性比例的检测；2.组织来源带有内源性荧光标记蛋白的细胞比例情况，例如细胞示踪实验；3.细胞自发荧光的测定，比如细胞富含某类化合物，而该类化合物具有较强的自发荧光，可以作为该类细胞的识别标志物。这三类实验基本只用单色或者两色的流式设备配置就可以开展实验。通常转染了只带有GFP标签蛋白的质粒细胞进行流式检测时，只需有488nm激光器，但是如果有mCherry之类的荧光蛋白，必需要有561激光器进行激发。如果带有GFP和mCherry两种融合荧光蛋白的小鼠组织来源细胞进行实验时，要注意两种荧光蛋白的表达水平，尤其是mCherry表达强而GFP表达弱时，mCherry的荧光溢漏会影响GFP通道，所以要利用合适的单荧光样品管作为单染管进行补偿调节。对于一些自发荧光的细胞，例如富含维生素A的细胞类型，可以用405nm激光器激发，450/50带通滤光片进行收集。对于这些荧光蛋白检测的实验，平台需要配备405nm/488nm/561nm的流式检测设备即可。

  细胞凋亡、倍型、周期是流式平台做的最多的和细胞生理健康相关的实验。细胞凋亡实验一般会采用PI/Annexin V-FITC双指数染色，只有488nm激光器的设备就可以满足实验需求，但是如果有488nm/561nm独立光斑的仪器就可以省略调补偿的过程。细胞倍型一般会采用Hoechst 33342进行染色，以区分单倍体、二倍体等。Hoechst和双链DNA结合后最大激发波长为350nm，最大发射波长为461nm，因此需要配备了355nm激光器的设备，450/50带通滤光片收集。细胞周期一般会采用PI染色的方法，488nm或者561nm激光器都可以激发。因此，对于细胞生理健康的检测，如果使用上述染料基本配备355nm/488nm/561nm激光器的流式检测设备即可。

  平台在多色流式细胞检测上主要围绕免疫细胞、造血干细胞、成体干细胞等的分型鉴定。多色流式检测从配色方案设计、设备选择、样品制备、上机和数据分析，过程相对更为复杂。因此，平台配备了4激光12色，4激光14色，5激光18色，5激光19色，5激光28色等多参数流式细胞仪，以满足各种实验需求。

  在实验过程中，如果多色实验，补偿调节依然是许多用户困惑的地方。如何获得正确的补偿矩阵是保证后期样品数据分析准确性的前提。现在的流式细胞分析仪基本都具备自动调节补偿的功能，因此可以用样品来确定各检测通道的电压后，用补偿微球进行补偿调节可以避免细胞阳性群不明显的困扰。

  随着仪器光路结构/检测器、电子元器件和分析软件的不断迭代，光谱流式技术的实用性得到了发展。在2005年的时候，Robinson等人提出了可以通过使用棱镜或光栅系统进行分光，配合32通道PMT或CCD检测器阵列可实现500-800nm波长范围内的全光谱信号检测技术。与棱镜分光相比，光栅分光系统可以通过单缝衍射原理对复合荧光实现均匀色散分光，在保证荧光信号真实性的基础上确保所有波段的荧光信号可以同时到达PMT检测器阵列中，实现全光谱信号检测的时空一致性，确保染料光谱的真实性。

  全光谱流式细胞仪可以跨越所有激光线，检测到可见光波长范围内（360-920nm波长）的全光谱信息，获得每一种荧光的整个发射光谱信息，最后利用WLSM算法（最小加权二乘法）对多个光谱进行拆分，获得每个单一荧光探针的完整光谱信号，从而避免使用传统的补偿计算矩阵，收集到更加全面与准确的荧光信号。因此，通过引入光谱流式技术，可以避免传统流式实验中高参数实验的补偿困扰。比如，通过光谱流式，平台已经实现了小鼠肠道23色免疫细胞分析方案、28色肿瘤免疫细胞亚群分析实验等。但是值得注意的是，光谱流式需要正确的光谱信息，比如样品固定会影响光谱信号，所以固定前后需要建立不同的荧光光谱库。

  流式分析上样方式除了传统的5ml流式管上样外，现在的注射泵和蠕动泵进样方式还可以支持1.5ml EP管上样。而对于一些高通量筛选的时候，尤其是悬浮细胞，利用高通量上样器可以很好地解决这类实验数据采集问题。尤其是带有声波聚焦技术的出现，可以将待测细胞精确聚焦在样本流的中心位置，每个细胞样本都可以准确地聚焦在激光检测区，即使在高流速1ml/min进样速度也能保证信号的变异系数较小，数据质量更高。同时伴随注射泵式的上中下三点混匀模式和推入式进样可以最大限度避免细胞堵塞，从而实现提高样本通量的同时，保证读取样品速度及获取的数据质量和精度。平台配备这种高通量流式检测设备可以提升科研的效率，有效节约科研工作者的时间成本。

  常规流式细胞分选早期是基于空气激发原理，此类流式分选仪低压高频的分选特点保证样品分选速度快，对分选后细胞的活性保持得更好。但是它需要手动校准光路和液路，对仪器操作者的技术要求很高，对环境条件的要求也比较苛刻。随着技术发展，现在大型仪器平台都会配备基于石英杯激发原理的流式分选仪，因为是固定光路，只需对仪器进行基本的质控校准和液滴延迟校准，使得分选仪开机工作变得相对简便。加电式的分选模式基本对细胞的活性都会有损伤，所以在分选速度、纯度和活性三者之间如何进行条件优化也是对仪器操作者的一种考验。对激光器的配置要求可以根据实验需求来决定。以我们平台为例，因为有大量的分选实验涉及单倍体细胞的分选，需要使用核酸染料Hoechst 33342，以区别不同倍型细胞中处于不同减数时期的细胞，因此需要功率可调的355nm激光器进行激发，保证此类核酸染料的激发效率。根据DNA浓度和DNA构型，使用450/50（Hoechst Blue）和670/30 （Hoechst Red）带通滤光片双指数显示获取数据。但是核酸染料的使用也往往造成管路、流动室等位置会有样品或染料残留，需要更多的维护时间和人力成本，同时不可避免地减少了可使用机时。因此从平台的用户群角度出发，可以将355nm激光器和405nm激光器分开配置到两台设备，这样可以兼顾保证核酸染料用户群和多色分选用户群的使用需求，也最大程度地避免了两类样品的交叉污染。

  芯片式流式分选仪最大的特点在于“分选芯片-喷嘴一体化”代替传统的石英杯与喷嘴，因此避免了因流动室或喷嘴支架无法更换造成的样品残留和污染。更换了新的芯片后，可以真正将样本在流动室中的残留率降低到零，这种设计对细胞移植和生物危害性样本分选等对交叉污染零容忍的分选应用更为友好。

  传统流式细胞分选仪在实验前须对仪器进行一系列复杂的调试步骤，包括光路校准，液流断点优化、侧液流校准和液滴延迟计算等，对仪器操作人员的依赖性更大，普通用户短时间内难以掌握。

  微流体芯片分选仪已经实现了上述所有调试和校准步骤自动化，并能在分选过程中对液滴状态进行实时监控和自动调节，简化了仪器操作过程，保证了每日仪器状态的稳定性，而且还能匹配不同规格的微流体芯片（70um，100um，130um）可以适用于更多的细胞类型。校准模式中还设计了大液滴模式，液流会更加稳定，更加适用于大细胞和多孔板（96或者384孔板）的分选。鉴于这种芯片式流式分选的特性，平台中一些抗体的单克隆筛选，384孔板测序建库，原代神经细胞等实验会借助这种分选平台进行。

  免疫磁珠分选主要基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，而没有这种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，先被洗脱下来，撤离了磁场后，带有抗体的细胞再被洗脱下来。因此，可以快速地分选得到阴选和阳选的细胞。

  作为一种功能较为独立的分选设备，磁珠分选主要应用于简单抗体标记的细胞分选和稀有细胞样品前期的富集，提高目的细胞的比例，可以帮助缩短在后期的流式细胞分选的时间提高获取细胞的纯度。分选后细胞纯度高、活性大，通过阳选，还能有效去除细胞碎片。但是对于一些需要内源蛋白标记的细胞还不能通过这种技术实现快速的分选。

  三、流式平台管理心得和未来可提升空间第一、 在流式使用方面，日常的维护是必不可少的，特别是使用频率特别高或者使用核酸染料样品较多的设备，可以将仪器维护频率提高到一周一次大清洗，同时在每一个用户实验结束后配合使用高浓度clean液-Rinse液-去离子水的冲洗流程，最大程度地保证管路和流式室的清洁，保证仪器正常的使用状态。

  第二、 对流式技术人员的要求日渐提升，除了会日常的开关机、维护、指导学生上机实验外，需要技术人员对不同样品的特性有更多的认知，判断其数据采集或分选过程中结果不如预期的潜在关键所在，此外还需要具备简单故障排除和硬件故障断定的能力，以缩短流式维修时间成本。

  第三、 平台设备需要密切结合用户群的实验特性、使用频次、科研目的等关键指标进行合理的配置，同时也要关注平台的技术空白和短板，予以填补和提升。

  第四、 随着对外泌体、病毒、细菌、亚细胞结构如线粒体等天然纳米颗粒检测需求的提升，可识别直径小于100nm颗粒的纳米级流式细胞术因其在外泌体研究、囊泡运输、纳米药物开发等方面的应用，可以作为纳米尺度小颗粒检测的金标准。

  第五、 随着光谱分析技术的提升，解决了光谱数据实时解析的问题后，整合了空气激发、低压高频、全自动校准、生物安全等功能的全光谱流式细胞分选仪势必在高参数高速流式分选中发挥更重要的作用。

  最后，国产流式技术团队在整机开发、配套试剂、技术能力、科研应用、售后服务等方面的不断提升，例如国产光谱流式、国产质谱流式在科研平台的落地化比例逐年上升。

  俞珺璟，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学和细胞生物学研究所）细胞分析技术平台副主任，博。