活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜 (Formazan) 并沉积在细胞中，但死细胞无此功能，后经 DMSO 溶解，于 490 nm 处测定吸光值便可间接反应细胞活力。但该方法除去操作步骤耗时以外，生成的 Formazan 是不溶于水的，需经 DMSO 溶解后才能检测，增加了工作量的同时仍不能保证测定结果的准确性，且该溶剂对具有明显毒性。

　　CCK8法：相较于 MTT，无论是操作步骤还是检测时间都优化了很多。CCK8 是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测方法(可看往期推文 CCK-8，让细胞活性检测 So Easy!)。但在实验时，一直有个问题让人很困扰——“细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅”，但这个颜色深浅的标准我 “标” 不出来怎么办？痛点！痛点！痛点！

　　科研汪 ：MTT 作为“元老”级别的检测方法，虽然“老练”，Paper 无数，但麻烦是线 法倒是便捷很多！

　　小 M：CTG 细胞活力检测，简单、灵敏、快速的均质检测方法，反应 10 分钟即可得到“Bling Bling”的检测结果，你就说“快不快”？

　　CTG发光法：基于高灵敏度生物发光检测技术，通过对三磷酸腺苷 (ATP)进行定量以测定培养物中活细胞数目及细胞活力。该实验方法可用三个字简单概括“快、准、狠”，比 MTT 的处理速度快近 20 倍，节省时间近 4 小时。CTG 特有的均质检测法即“加样-混样-检测”，使用时，只需将本试剂等体积添加至培养细胞中即可进行检测。不用感慨，细胞活力检测为什么不能如此简单？

　　首先，来了解实验CTG 发光法的测定原理：ATP 作为细胞新陈代谢的一个重要指标，与活细胞数目呈良好的线性关系，是细胞活力检测的重要标志性分子。ATP 生物发光的原理为：荧光素酶以荧光素、ATP 和 O2 为底物，在 Mg2+存在时，可将化学能转化为光能；在荧光素酶催化的发光反应中，ATP 在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系，即在光信号与酶反应体系中，发光值与 ATP 呈正比，ATP 与活细胞数成正比，CTG 发光法通过 ATP 含量来进行细胞计数或活力测定，且不受化合物自发荧光的影响(图 2)，是细胞增殖测定，细胞活力测定和细胞毒性高通量筛选分析的理想选择。

　　CTG 发光细胞活力测定：TNBC 细胞在 37°C 下培养过夜。然后，将 100 µL CTG 溶液直接与培养基混合，在室温下培养 20 分钟。结果显示，转染靶向 SIPL1 shRNAs 的 BT-549 和 MDA-MB-231 细胞系的细胞增殖显著降低(图 3)。

　　如图 4 所示，为了探究外源 RRM2 是否会影响肝癌细胞的铁死亡，在 HepG2 和 SMMC-7721 细胞中过表达或敲除 RRM2，通过 CTG 法检测其对细胞活力的影响。结果表明，过表达 RRM2 时，细胞活力明显增强，反之，敲除RRM2时，细胞活力明显降低[1]。

　　如下图所示，作者团队报告了一种基于浓度-反应曲线的表型定量高通量筛选 (qHTS)，旨在识别对疟原虫肝脏和无性血期寄生虫具有活性的化合物(图5)。使用 SYBR Green 或荧光素酶来测试对寄生虫生长的抑制，共检测了 456,817 种化合物。

　　在 qHTS 之后，又分类选择了 4,253 种合成易处理的化合物，用于验证抗疟原虫活性和哺乳动物毒性。在 3 μM 和 1 μM 浓度下对化合物进行体外抗伯氏疟原虫肝期寄生虫的评估。其中使用 CTG 法评估了所有 4,253 种化合物对 HepG2 的细胞毒性。其中 255 种化合物对 HepG2 细胞表现出一定程度的生长细胞毒性，AC50 值 43 µM (随后被排除)。最终筛选出 994 种经过验证的无毒性化合物，用于针对肝阶段寄生虫的后续评估。

　　对比测试结果表明：持续 3 h 的生物发光稳定性的检测中，MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 的发光信号值比较稳定 (图 5a)；不同细胞数的线性范围中，MCE 产品线性关系良好，与进口 竞品线b)；且对于不同细胞系，MCE 产品与进口竞品检测信号值相当 (图5c)。综上检测结果表明，MCE CTG 试剂盒可实现稳定、灵敏、批次间差异较小的不同细胞系的细胞活力检测。

　　1. 荧光素酶的活性对温度较为敏感，反复冻融会致其逐渐失活，建议分装冻存，避免反复冻融。冻融时，可能会导致试剂中出现少量沉淀，可平衡至室温后观测沉淀溶解情况，如仍有残留，可离心后去除。

　　3. 若待测药物的溶剂含量较高，荧光素酶反应可能会被干扰，致化学发光信号受到影响，可设置含有溶剂的细胞培养液的对照孔以排除此干扰。

　　4. 检测时需使用适合于细胞培养的白色或黑色的多孔板 (96 孔板或 384 孔板)，普通透明多孔板的相邻孔之间可能会产生相互干扰。如使用透明板，可使用不透明的白色胶带粘贴孔底。