国家药品监督管理局（NMPA）的专家团队最近发文中讨论了mRNA疫苗质量控制研究的进展，并提出了相关的挑战和对策，以期为今后mRNA疫苗质量控制研究提供参考。

　　线性mRNA疫苗和saRNA疫苗的生产过程可以概括为质粒DNA的制备、线性化DNA模板的制备和纯化、体外转录（IVT）、mRNA加工和修饰、mRNA纯化和脂质纳米颗粒（LNP）包封（图1）。

　　circRNA疫苗的制造过程类似于线性mRNA疫苗，但需要对制备的RNA进行体外转录，然后进行环化反应 （图2）。与线性mRNA疫苗的序列和结构相比，circRNA疫苗的RNA结构是圆形的，缺乏5′帽结构，因此依靠内部核糖体进入位点（IRES）启动翻译。此外，它缺乏 3 poly (A)尾部结构，其圆形结构反而增强了其稳定性。此外，circRNA 疫苗也缺乏 5 和 3 非翻译区（UTR），但含有具有 I 型或 II 型组内含子的自剪接序列，以诱导其RNA前体的环化。此外，它们可以使用T4 RNA连接酶在没有此类序列的情况下进行环化，但这在当前的制造过程中很少使用。有趣的是，目前正在开发的circRNA疫苗是在不使用修饰核苷酸的情况下生产的。

　　2020年12月，世界卫生组织（WHO）发布了技术文件《mRNA传染病预防疫苗的质量、安全性和有效性评估：监管注意事项》（以下简称WHO指南），其中涉及用于预防人类传染病的LNP递送、活性免疫、线性mRNA和saRNA疫苗。该指南酌情提出了疫苗生产、质量控制、非临床和临床评估中关键因素的关注领域和监管考虑因素，以及开发多价mRNA疫苗或修改某些病原体（如流感病毒或SARS-CoV-2）现有疫苗株的具体考虑因素。除了典型的研发注册注意事项外，该指南还为在突发公共卫生事件期间快速开发优先疫苗提供了建议。2022年2月，美国药典（USP）发布了第一版《mRNA疫苗质量分析程序——线性mRNA疫苗和自复制mRNA疫苗指南草案》，重点关注mRNA物质，并提供了评估mRNA特性、纯度、含量、物理状况（完整性）和安全性等质量属性的方法。

　　2023年4月，针对线性mRNA疫苗和自复制mRNA疫苗发布了第二版《mRNA疫苗质量分析程序——指南草案》（以下简称USP指南第二版），适用于整个mRNA疫苗产品的全生命周期。基于质量源于设计（QbD）的概念，表征和放行测试分为三个主要阶段：质粒DNA模板、mRNA物质和mRNA疫苗。新增残留T7 RNA聚合酶含量作为质控项目，并针对各质控项目增加相关检测，如酶联免疫吸附测定（ELISA）检测残留dsRNA，高效液相色谱（HPLC）与气雾式检测（CAD）对LNPs脂质成分进行定性和定量检测。

　　2024年4月，为了满足全球对欧洲及其他地区mRNA疫苗通用质量标准的需求，欧洲药典正在同时制定一系列三个新的通用文本，即人用mRNA疫苗（5.36）;用于生产人用mRNA疫苗的mRNA物质（5.39）;用于制备mRNA物质的DNA模板（5.40），涉及与mRNA疫苗及其成分的生产和控制相关的关键方面，旨在支持全球的开发商、制造商、监管机构和国家控制实验室。

　　中国国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）发布了《COVID-19预防性疫苗技术指南（暂行）》（以下简称《预防性疫苗技术指南》），指导了紧急情况下mRNA疫苗的研发，并明确了该研究的当前基本要求。这些指南通常仅适用于非自复制mRNA疫苗；对于自复制mRNA疫苗，还必须根据相关产品特性和属性进行相应的研究。这些包括模板设计;构建含有转录模板的质粒;制造工艺;质量特征研究;质量标准;稳定性研究;研究与产品直接接触的包装材料的来源、选择和质量标准;紧急情况下药理学发展的定期考虑，以及过程中的任何变化。此外，在mRNA疫苗的质量控制过程中，包括疫苗的非临床/临床试验、药物生产、药物运输和储存、疫苗稳定性研究以及疫苗上市后的变化，应参考WHO和其他监管机构发布的其他相关技术指南。

　　USP指南第二版基于线性mRNA疫苗和saRNA疫苗的生产工艺，对质粒模板、mRNA物质、mRNA药品的检测规定了相应的检测项目，并推荐了相应的分析方法。这些应基于质量属性和分析方法、多批次的稳定生产以及建立质量标准的相关准则。

　　由于其生产过程特有的环化反应，circRNA疫苗还需要对环化程度进行质量控制，但不需要质量属性，例如5加帽效率和3poly (A)尾长。世卫组织指南建议，在开发的早期阶段，质量标准可以相对宽松，最终标准应基于在临床试验中被证实安全有效的检测批次的结果。CDE指南要求提交批准用于临床的疫苗具有基于工艺验证数据的初步质量标准。上市后应按照相关指引进行风险控制分析，并提供完整的质量标准和工艺验证。

　　2002年，美国食品和药物管理局（FDA）宣布了“21 世纪药品现行良好生产规范（CGMP）”倡议，引入了QbD的概念作为新药开发和质量控制的基本工具，并建议使用过程分析技术（PAT）来实施QbD。在QbD框架下，开发周期从确定患者需求并使用它们来定义质量目标产品概况（QTPP）开始。随后，建立产品的关键质量属性（CQA）及其使用范围和风险评估，整合有关产品安全性和有效性的临床和非临床数据。接下来，根据对制造过程如何影响产品CQA的理解来定义关键工艺参数（CPP）的范围。通过对产品过程的理解，在CPP和CQA之间建立了数学关系，从而在操作层面上获得疫苗生产过程的模型。然后，该模型用于确定产生所需CQA的CPP范围，从中可以创建设计空间，并在其中定义称为正常工作范围（NOR）的子空间。

　　一项研究利用QbD框架中的实验设计（DOE）工具构建了一个mRNA疫苗平台，该平台可以生产多分散指数（PDI）≤0.30、粒径为60–180nm的mRNA疫苗。据报道，通过评估影响mRNA疫苗有效性和安全性的因素，QbD框架可产生一系列质量属性，包括RNA序列完整性、RNA序列准确性、RNA产量、5′加帽效率、残留宿主细胞蛋白和DNA、残留模板DNA、内毒素、过滤后pH值和盐浓度。

　　世卫组织指南要求开发和验证分析方法，以鉴定、纯度和工艺生产的纯化mRNA的含量，以及关键质量属性，例如影响安全和质量的属性。此外，必须根据这些准则确定与方法学验证（例如精确度）相关的可接受项目范围。最近发布的ICH Q14和Q2（R2）指南表明，基于分析质量源于设计（AQbD）框架和产品生命周期概念的生物制剂分析方法的开发和验证，包括分析靶点概况、技术选择、风险评估、实验设计和优化、方法操作设计区域和持续监测，为确保检测的长期稳定性提供了基础。CDE指南要求在提交时提供的检测验证数据能够初步确认检测的适用性。对于CQA检测（如封装效率、封盖效率和效力），应在上市阶段提供验证与研发阶段质量控制的一致性或适用性的信息和重要性，以及完整的检测验证数据。

　　世卫组织指南要求疫苗制造商建立化验标准化参考标准;使用工程运行批次的mRNA疫苗作为早期开发的参考;确定和表征适合在高级开发中进行商业生产的临床试验批次;在申请上市许可时提供有关参考标准的信息;并选择经过临床评估并在化学成分、纯度和生物活性方面充分表征的合适批次作为候选参考物质。CDE指南要求制造商在提交时制定用于测定核酸含量、纯度和生物活性的参考标准，并提供有关参考标准的来源、制备、测试结果、校准过程和稳定性研究的初步研究数据。为了比较不同研究机构疫苗的检测结果，应制定国际或国家对双链RNA（dsRNA）和T7 RNA聚合酶等关键残留杂质及其体外生物活性的参考标准，以标准化和协调关键杂质和效力的测定。

　　目前，mRNA疫苗的CQA检测方法已经明确，但仍有一些方法需要优化。例如，mRNA加帽可以通过IVT过程中的共转录加帽或IVT过程后的酶加帽来完成。常用的Cap类似物包括ARCA、Cap 0和Cap 1结构类似物。现有的帽效率测试方法难以高分辨率地分离和鉴定不同帽类似物的RNA片段，因此也需要优化。

　　目前，QbD在疫苗开发、生产、质量控制中的应用不如在小分子药物开发中成熟。使用QbD框架开发mRNA疫苗，在产品研发、设计过程中应充分考虑成品疫苗的CQA，对产品进行优化和改进，以提高其质量。据报道，mRNA疫苗生产工艺的设计需要全面了解CQA、CPP和CMA之间的关系。在疫苗生产过程中引入多种实时监测工具（PAT），可以对疫苗CQA进行实时监测，确保成品质量，从而加速mRNA疫苗的研究、开发、生产和审批。

　　QbD和实验设计（DOE）工具的应用可以表征生产过程中CPP对CQA以及设计空间的影响。此外，还整合了定性和定量方法的新数学模型，以评估CPPs（如三磷酸核苷酸和Mg）效应的方向、程度和特征2+浓度、T7 RNA聚合酶浓度和疫苗CQA上的反应时间，例如mRNA完整性和序列准确性。这些模型可用于量化和绘制四种CPP对mRNA产量的影响，从而为mRNA制备反应系统提供操作设计空间。Bryśkiewicz等人得出的结论是，QbD在mRNA-LNP药物产品开发中的实施与递送系统的结构和主要治疗靶点密切相关。用于RNA递送的LNP制剂的质量靶标产品概况（QTTP）是安全性、有效性和药用性。CQA包括粒径、多分散指数（PDI）、包封效率和脂质含量。CMA包括氮/磷比、脂质类型和生物降解性。CPP包括温度、微流体和过滤。由于这些疫苗的CQA由CMA和CPP确定，因此用于优化LNP的设计。

　　目前，mRNA疫苗的效力主要通过体外细胞蛋白表达进行评估。然而，mRNA疫苗的组成更为复杂，蛋白质表达以外的因素，如可电离的阳离子脂质，可能会影响疫苗的免疫原性。主要残留杂质的含量也会影响疫苗的体内活性。因此，开发准确反映体内疫苗活性的体外效力测试方法和标准仍然是质量控制的关键瓶颈。线性 mRNA 疫苗的一个优点是它们可以显著激活 T 细胞免疫。然而，由于影响实验过程的因素众多，疫苗诱导的T细胞免疫测定的标准化存在困难，这给mRNA疫苗诱导的T细胞免疫反应的标准化评估带来了重大挑战。

　　世卫组织出版物《mRNA疫苗预防传染病的质量、安全性和有效性评估：监管考虑》建议，一旦生产过程得到充分验证，可以减少或停止对相关杂质残留水平的检测，以证明其适当的去除效果，并证明生产一致性。如果国家监管机构同意。对于主要残留杂质的质量控制，制定标准化的质量控制方法和质量标准时，应充分考虑生产工艺、杂质的生物效应、对机体的影响。

　　线性mRNA疫苗具有不同长度和结构的dsRNA，例如互补发夹和双链结构。不同的dsRNA激活具有不同特征的先天免疫反应;一些dsRNA可作为佐剂，而另一些dsRNA可能会诱发炎症。目前，使用J2/K2单克隆抗体的ELISA或免疫印迹方法用于检测残留的dsRNA。有研究报道，不同形状的dsRNA与J2/K2单克隆抗体的结合亲和力不同，影响检测精度。USP发布的第二版“mRNA疫苗质量分析程序指南草案”建议使用基于K1/K2单克隆抗体的ELISA或免疫印迹方法进行 dsRNA检测，但其适用性需要验证。

　　因此，有必要开发和优化残留dsRNA的标准化检测方法。另一种可能性是开发一种基于细胞的检测方法，用于检测残留的dsRNA。在建立生产工艺后，也可以阐明疫苗中存在哪些类型的残留dsRNA，然后对这些dsRNA进行质量控制。据报道，残留的dsRNA水平低于1 ng/μg RNA，但目前尚无以此作为质量标准的研究数据。在USP发布的第二版“mRNA疫苗质量分析程序-指南草案”中，ELISA被新增为残留T7 RNA聚合酶质量控制检测的检测方法。应评估用于检测残留 T7 RNA 聚合酶的标准化测定和参考范围的发展。

　　疫苗稳定性对于确定疫苗的保质期和保存条件至关重要。然而，mRNA疫苗的稳定性尚未得到彻底研究。世卫组织出版物《mRNA疫苗预防传染病的质量、安全性和有效性评估：监管考虑》建议制造商向国家监管机构提供足够的数据，以证明产品在储存、分销和使用条件下的稳定性。世卫组织科学委员会最近关于mRNA疫苗技术的一份报告强调，应在高温条件下研究mRNA疫苗的稳定性。研究发现，线性mRNA疫苗中可电离阳离子脂质的叔胺基团在长期储存过程中的氧化和水解会产生活性成分，这些活性成分与mRNA分子发生化学反应，导致无效翻译成蛋白质，从而影响疫苗的免疫原性。温度、pH值、光照、湿度、缓冲剂类型、关键储存物品（如冷冻保护剂和分散剂）、反复冻融等条件等条件都会影响mRNA疫苗的稳定性;应尝试确定mRNA疫苗的降解模式。

　　此外，应开展线性mRNA疫苗的体内稳定性研究，为提高疫苗免疫原性提供参考。据报道，储存稳定性受核酸结构差异和碱基配对程度的影响。单链RNA结构比例较高的疫苗稳定性较差。LNP结构组装在微流体通道中，并在透析后完全展开。这个过程会影响LNP-mRNA疫苗的CQA，包括其稳定性。一项研究比较了直接使用pH 7.6缓冲液或使用pH 4.0缓冲液后使用pH 7.6缓冲液的切向流过滤透析对mRNA疫苗稳定性的影响;两步透析法使制备的mRNA疫苗具有良好的储存稳定性，在5°C或−20°C下储存至少6个月，粒径增加，空载体率降低。使用超分子化学设计的具有三个叔胺基团的新型阳离子脂质确实改善了与RNA的结合，并且其结构中羟基和酰胺键的异构化提高了LNP的稳定性。封装的mRNA疫苗在4°C和37°C下储存两个月;该制剂具有稳定的特性，并且在动物中耐受性良好，表明可以通过优化LNP脂质的分子设计来提高mRNA疫苗的稳定性。

　　LNP用作mRNA疫苗的递送系统。对于新型辅料（例如阳离子脂质），应尽可能提供有关生产过程和质量控制的详细信息，包括原材料和中间体。应对LNP进行详细表征，并具体描述可能影响疫苗质量、安全性和有效性的任何制剂特征，在制剂开发过程中应考虑其影响。LNP脂质组合物中可电离脂质的比例影响mRNA疫苗的包封速率和纳米颗粒自组装过程;脂质种类、头基的电荷和尾部的疏水性会影响mRNA疫苗的粒径、形态和稳定性。

　　USP发布的第二版“mRNA 疫苗质量分析程序 - 指南草案”中增加了使用配备CAD的HPLC对mRNA疫苗中的脂质成分进行定性和定量检测。mRNA疫苗中的可电离阳离子脂质已被证明可以激活先天免疫反应并作为疫苗佐剂。胆固醇还可能激活先天免疫反应并作为疫苗佐剂，因此有必要研究和阐明 mRNA 疫苗的生物学功能，并建立有关这些功能的质量标准。有研究报道，LNP内核中水的存在会影响mRNA疫苗的储存稳定性，其含量主要与脂质组成和与mRNA组装后的内部结构有关。

　　saRNA疫苗的生产工艺与线性mRNA疫苗相似，因此线性mRNA疫苗的质量控制可以作为参考。然而，sa-mRNA疫苗的特性（例如其较长的序列）产生的特定测试项目、方法和参考范围值得关注。

　　由于saRNA疫苗中编码的额外RNA依赖性RNA聚合酶使它们能够合成自己的序列，长度可达约7,000 bp，可能使它们更容易降解，因此对saRNA疫苗稳定性的研究应成为优先事项;然而，目前关于saRNA疫苗稳定性的研究很少。已经研究了某些特定的碱基序列或RNA空间结构是否易降解，这些疫苗的降解模式以及可用于表征这些疫苗中发生的降解的早期和敏感指标。导致体内稳定性的较长序列也值得关注。

　　mRNA序列的同一性、完整性和纯度是疫苗CQA。更长的saRNA疫苗序列是IVT面临的主要挑战，确保目标产物序列的准确性、完整性和纯度也是如此。体外转录反应系统各组分的比例将与线性mRNA疫苗的比例不同。应构建模型来调查和量化CPP和CMA对自复制mRNA疫苗CQA和最终产品质量的影响，并基于QbD框架和DOE工具确定操作设计空间。线性化DNA模板的质量已被证明对saRNA疫苗的体外转录过程有重大影响。Samnuan等人发现镁2+含量及其与核苷三磷酸的相互作用显著影响了mRNA的质量和产量，其中乙酸根离子对体外转录过程的影响程度大于Cl−离子，添加乙酸钠不会进一步增加RNA产量，并且焦磷酸酶对体外转录不是必需的。

　　关键残留杂质是saRNA疫苗的CQA。在体外转录和mRNA制备过程中产生不同结构和长度的dsRNA。此外，saRNA疫苗在体内复制，使得靶mRNA序列也会在体内形成dsRNA结构。这种情况导致先天免疫反应的激活，这可能与线性mRNA疫苗不同。因此，saRNA疫苗中残留dsRNA的质量标准可能与线性mRNA疫苗不同，需要进一步研究。与线性mRNA疫苗一样，应进行残留T7 RNA聚合酶的质量控制研究。

　　粒径已被证明是saRNA疫苗的CQA，对载药量、稳定性、生物分布、细胞摄取、内吞作用和释放以及免疫反应有重大影响。因此，稳健可靠的粒度分析方法对于满足多批次mRNA疫苗生产的产品质量一致性要求至关重要。现在人们普遍认为mRNA疫苗颗粒具有均匀的球形结构。动态光散射（DLS）已用于确定其大小。然而，最近发现，使用不同的测定技术，具有不同比例脂质成分的saRNA疫苗表现出非球形、异质、“双核”结构，具有脂质和水性隔室以及颗粒间变异性 。这种“双核”结构是由于在制备mRNA-LNP溶液过程中pH值升高，导致可电离脂质变为中性并削弱与mRNA的相互作用。这导致亲水性（mRNA）和疏水性（脂质）核心之间的分离，它们在分离后被两亲性DSPC脂质稳定。进一步的实验表明，这些结构数量的增加导致封装率降低。非球形、不均匀的“双核结构”是否会影响DLS确定的粒径和粒径分布结果的准确性仍有待研究。目前与mRNA疫苗相关的指南均未明确提及mRNA疫苗颗粒形态结构的质量控制。

　　线性mRNA疫苗的质量控制仍可作为circRNA疫苗质量控制的参考。然而，由于circRNA疫苗的固有特性（例如循环化程度的质量控制）而产生的独特测试项目、检测方法和标准范围值得关注。

　　环化效率是circRNA疫苗的CQA，通常使用毛细管电泳（CE）确定。然而，由于mRNA环化前体和circRNA序列的分子量相似，使用该方法时环化速率的分辨率并不理想，这会影响结果的准确性。因此，参考ICH Q2和Q14指南，通过使用与现有检测方法或此类检测组合具有不同基本原理的检测方法的策略，开发和验证了circRNA疫苗的循环化速率检测方法。例如，可以考虑将CE和反相高效液相色谱法相结合

　　当RNA通过与I型或II型内含子的自剪接进行环化时，较高的环化程度不仅导致更高的circRNA产量，而且有利于疫苗质量控制。研究表明，较高的环化程度不仅与自剪接内含子有关，还与靶mRNA序列有关，这可能是由于不同RNA序列产生的空间结构不同所致。总之，两者应选择相辅相成，以产生更高的循环化率。在最近的研究中，人工智能已被用于筛选与目标序列匹配的自剪接内含子序列元件，然后通过实验与合适的序列进行比对。此外，使用DOE工具可用于优化CPP和CMA，以提高循环化率，并使用模型量化来确定操作设计空间。

　　RNA同源臂在mRNA环化过程中被消除。未成功环化的 mRNA 前体分子与多个 mRNA 分子一起环化以形成多聚体结构。这些结构对疫苗功效的影响应通过实验确定，以及这些杂质是否与工艺或产品相关的杂质，以及相关的质量标准。目前的circRNA疫苗缺乏修饰的核苷酸，这意味着体外转录过程中产生的dsRNA可能与线性mRNA疫苗生产过程中产生的dsRNA不同。dsRNA也是在环化反应过程中产生的，circRNA激活先天免疫反应的特征也可能与线性mRNA不同。因此，circRNA疫苗中残留dsRNA的质量标准可能与mRNA疫苗不同，应研究circRNA疫苗中残留dsRNA的检测方法及其相关质量标准。此外，应进行残留T7 RNA聚合酶的质量控制研究。

　　虽然circRNA更稳定，但它仍然可以被RNase切割。开放环状mRNA的分子量与母体circRNA的分子量相同。因此，如果基于分子量的方法（如CE）无法区分 circRNA 和切口环状 RNA，那么在开放环状mRNA的 3端添加一个poly (A) 尾可能有助于确定疫苗中开放环状mRNA的含量。然而，该方法的准确性可能会受到多聚腺苷酸化效率的影响。由于circRNA和切口环状mRNA具有不同的结构，因此也可以使用大小排阻-高效液相色谱（SEC-HPLC）来研究circRNA和切口环状mRNA是否能有效区分。circRNA分子在长期储存过程中是否也会与LNPs的脂质成分发生化学反应并影响翻译效率，还有待研究。研究表明，与线性mRNA疫苗相比，circRNA疫苗的蛋白质在体内表达的时间更长，但没有相关研究表明这是因为circRNA疫苗在体内更稳定且更不易降解，还是因为它们的翻译效率更高或翻译持续时间更长。

　　近年来，mRNA疫苗技术发展迅速，COVID-19大流行加速了mRNA疫苗上市的批准。mRNA疫苗技术在传染病预防和癌症治疗性疫苗方面具有巨大的应用潜力;mRNA疫苗的质量控制也成为研究的重要课题。

　　QbD在mRNA疫苗技术的开发中至关重要，在设计阶段就应充分考虑最终疫苗产品的质量。结合疫苗特性和相关指南，根据CMA和CPP研究和确定mRNA疫苗的CQA。根据ICH Q14和Q2（R2）指南，基于AQbD框架和产品生命周期概念开发和验证相应的质量控制方法。在开发的早期阶段，质量标准可以相对宽松，但最终标准应基于在临床试验中被证实安全有效的测试批次的结果。

　　三种mRNA疫苗的质量控制仍面临许多挑战。线性mRNA疫苗的质量控制研究进展迅速。中和抗体检测的一些因素会影响结果的准确性和可重复性，例如病毒和血清的孵育时间、细胞接种密度。因此，应开发用于中和抗体效力的标准化测定方法。已发表的研究采用AQbD概念，为接种COVID-19疫苗的临床样本建立了标准化的中和抗体分析程序，可以减少实验室误差，并提供了一种比较不同COVID-19疫苗有效性的方法[引文79].目前仍缺乏针对降解模式和关键杂质（如残留dsRNA和T7聚合酶）的标准化检测方法，应制定具有详细科学依据的参考标准。saRNA疫苗和circRNA疫苗的质量控制可以参考线性mRNA疫苗的质量控制进行，但由于saRNA疫苗的序列较长，因此应注重体内和体外稳定性，这使得它们更容易降解。此外，纳米颗粒的形貌和结构对粒径的影响也值得关注。

　　对于环状RNA疫苗，应建立特定的标准化检测和质量标准，以确定环状化程度。随着对mRNA疫苗研究的不断深入和mRNA疫苗技术的不断发展，世卫组织和其他国家监管机构也应不断更新和完善mRNA疫苗指南，及时建立国际或国家参考标准。在国际上协调准则和参考标准非常重要。例如，应制定dsRNA和T7 RNA聚合酶等关键残留杂质及其体外生物活性的国际或国家参考标准，以标准化和协调关键杂质和效力的测定，并为全球mRNA疫苗的质量控制和评估提供工具。