2、m)。 3.12.3液封 在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。3.1.3浓缩胶的配置 .1 5%浓缩胶配方下表：5%胶蒸馏水30%Acr-Bis(29:1)0.5M Tris-Hcl PH 6.810%SDS10%AP(过硫酸铵)TEMED2 ml1.4 ml0.33 ml0.25ml0.02 ml0.02 ml0.02 ml3.1.3.2插入制胶梳 混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气

　　3、泡的出现。约30分钟，聚合完全。3.2. 电泳 安装电泳槽 将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly电泳缓冲液。3.2.2 样品处理 对于蛋白样品直接取80l的样品，依次加上20l 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。 加样 用移液枪取处理过的样品溶液10l，小心地依次加入到各

　　4、凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。3.2.4 电泳 将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。3.2.5剥离胶 把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。3.4.脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小

　　5、时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。3.5.拍照 将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到扫描仪上，拍照。4. 注意事项4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD选用10%胶；50KD-30KD选用12%胶；30KD-10KD选用15%胶。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作.4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。4.

　　6、5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。4.6 分离胶高度控制得当，确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。l 配胶用的试剂，要提前配好：30%丙烯酰胺贮存液丙烯酰胺29.2g，亚甲双丙烯酰胺0.8g，混匀后加ddH2O，37溶解，定容至100ml，棕色瓶存于4。1.5MTris-HCl(pH 8.0)：Tris base 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.

　　9、）（3ml）：ddH2O 2.1 ml30%丙烯酰胺贮存胶0.5 ml1M Tris-HCl 0.38 ml10%SDS 0.03 ml10%AP 0.03 mlTEMED 3.0 l将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干多余水份，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。4、待积层胶完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上。5、样品处理：将样品加入等量的2SDS上样缓冲液，100加热3-5min， 12000g离心1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白质Marker作平行处理。6、上样：取10l诱导与未诱导的处理后的样品加

　　10、入样品池中，并加入20l低分子量蛋白Marker作对照。7、电泳：在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止（约需2-3h）。8、染色：将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，室温4-6h。9、脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。10、凝胶摄像和保存：将脱色好的凝胶摄像，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。注意事项：1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。3、未聚合的

　　11、丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。周师姐 试剂配制：l 30%丙烯酰胺(29:1)配制：称取Acrylamide 29 g、Bisacrylamide 1 g，加入约60 ml的去离子水，充分搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至100 mL，用0.45um滤膜滤去杂质，于中4避光保存。l 5Tris-Glycine电泳缓冲液的配制：称取Tris-base 15.1 g、Glycine 94 g、SDS 5 g置于1 L烧杯中，加入约800 mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。l 10 %过硫酸胺(AP)的配制：称取

　　14、胺0.5 mL、去离子水2.1 mL、0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.375 mL、10 % AP 30 L、10 % SDS 30 L和TEMED 5 L充分混匀后灌胶。l 考马斯亮蓝染色液的配制：称取1 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中；量取250 mL异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；加入100 mL的冰醋酸，搅拌均匀；加入650 mL去离子水，搅拌均匀；用滤纸除去颗粒物质后，室温保存备用。l 脱色液的配制：量取冰醋酸 100 mL、乙醇50 mL，加去离子水定溶至1L，搅拌均匀，室温保存备用。l 转移缓冲液的配制：称取Tris-base 1.45 g、甘氨酸7

　　15、.2 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；加入100 mL甲醇，最后用去离子水定容至500 mL，室温下保存备用。 l 洗膜缓冲液(TBST)的配制：称取NaCl 8.8 g、Tris-base 2.42 g，向烧杯中加入约800 mL去离子水，充分搅拌溶解；用1 M HCl将溶液的pH值调至7.5，加入0.5 mL Tween 20后充分混匀；加去离子水将溶液定容至1 L后，于4 保存备用。l 封闭缓冲液的配制：称取0.5 g脱脂奶粉溶于10 mL TBST缓冲液中，充分混匀后备用。0.1 M 甘氨酸缓冲液配制：称取0.75 g甘氨酸加入90 mL去离子水，充分溶解后用pH计将pH值调至2.5，用去离子水定容至100mL后用0.22 m 微孔虑膜过滤除菌后，将其分装并于4 保存备用。l 1 M Tris-HCl 缓冲液的配制：称取12.1g Tris-base，加入90 mL去离子水，充分溶解后用pH计将pH值调至7.5，用去离子水定容至100mL备用。l 银染固定液：30 % 的乙醇，10%的乙酸。l 银染氧化液：称取0.7 g高碘酸溶于100 mL去离子水，充分混匀备用。 l 银染显色液：浓度为0.005 g/L的柠檬酸，0.02 %的甲醛。l 银氨溶液：浓度为0.67 % 的硝酸银，0.33 %的氨水，0.8 g/L的NaOH。

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