木兰科(magnoliaceae)植物主要分布于亚洲、美洲热带带地区，该科植物含2-17个属，种类240-300个种，主要分布于东南至西南部，向东北、西北逐步减少。木兰科植物是我国重要的观赏花木、传统中药及香精原料植物，在城市景观设计和经济作物栽培中广泛应用。因此建立快速的品种鉴定方法意义重大。目前，对于木兰科植物分类和鉴定研究中，通常以植物学形状特征和生化技术作为鉴定方法，但在实际应用中，木兰科各品种间植物学特征相似的情况很多，且此方法需要的周期长，对研究者的专业背景要求高，可行性不强。而利用与遗传相关的生理生化物质(如过氧化物酶、dna等)进行品种鉴定是较为简单、准确、快速的方法，但其难点是对于相关物质的提取和高效分离。因此开发出快速高效分离这些生理生化物质的方法，对于品种鉴定意义重大。近年来，有学者对7属11种木兰科植物的过氧化物酶同工酶进行了分析，还有学者对河南省木兰属9种植物过氧化物酶同工酶进行了研究，并对其形态分类提出了不同观点；但上述研究都是采用常规的植物过氧化物酶同工酶分离体系(碱性电泳)，这一体系对多数木兰科植物过氧化物酶分辨率较低，不能完全呈现研究对象所包含的全部过氧化物酶条带信息，例如厚朴叶采用上述碱性电泳只能分离得到5条过氧化物酶同工酶谱带，而采用本发明的方法则可以分离得到17条同工酶谱带。很显然，碱性电泳方法所获得同工酶条带信息很少，不能完整呈现该物种过氧化物酶的全貌，基于这些有限信息所进行的后续分类、鉴定等研究很可能就是盲人摸象，得出的结论会因为信息的不完整出现偏差甚至错误。发明人通过对不同凝胶缓冲体系、电极缓冲液体系的比较研究，得出木兰科植物过氧化物酶同工酶分离的电泳方案。

　　综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术对木兰科植物过氧化物酶分离效果不理想，所得酶谱信息不全，不能比较完整地反映过氧化物酶位点信息的全貌。

　　解决上述技术问题的难度和意义：获得信息量丰富的木兰科植物过氧化物酶同工酶酶谱可以有效识别不同种植物中基因的存在和表达；为研究木兰科不同种植物生物遗传差异、推断亲缘关系提供有效线索；进一步，可以为木兰科植物良种选育、品种鉴定等提供有效手段。其主要难度在于根据木兰科植物过氧化物酶的生物化学性质，探索出一种不同于常规的电泳凝胶缓冲体系以及与该缓冲体系相匹配的电极缓冲液体系和电泳分离条件，从而能够比较全面呈现木兰科植物过氧化物酶的完整信息。

　　本发明是这样实现的，一种木兰科植物过氧化物酶的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法，所述木兰科植物过氧化物酶的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法包括：木兰科植物叶过氧化物酶的提取；单向快速分离木兰科植物叶过氧化物酶；采用联苯胺法快速显色，显色完成后，选择epson扫描仪中的透射稿模式快速扫描染色后的凝胶。

　　进一步，所述木兰科植物叶过氧化物酶的提取具体包括：将新鲜采摘的木兰科植物叶片，用自来水洗净后，再用超纯水漂洗三次；用干净的吸水纸或脱脂棉将水吸干；采用冰浴研磨的方法提取叶片中的过氧化物酶。该步骤目的在于通过低温研磨防止酶蛋白变性。

　　进一步，所述提取叶片中的过氧化物酶具体包括：先将木兰科植物叶片用剪刀剪碎，并在分析天平上称重，叶鲜重：提取液体积按1:5比例加入50mmol/lph6.0乙酸盐缓冲提取液，冰浴研磨，在4℃10000g条件下离心10min，所得上清液按照10：1比例加入上样缓冲液，缓冲液含0.05％甲基绿的50mmol/lph6.0乙酸盐，贮存4℃冰箱备用。该步骤目的在于根据叶片中酶所处环境，利用保持酶活性的缓冲液使酶蛋白成分释放到缓冲液中，通过离心使酶蛋白和残渣分离，加入上样缓冲液中甲基绿主要是作为电泳蛋白迁移前沿的指示。

　　(1)采用循环水冷却电泳仪进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，压条封边后，将在4℃冰箱冷却的以交联度为4.7％的聚丙烯酰胺母液配制分离胶浓度7.5％，ph3.1丙烯酰胺分离胶，灌注至梳子下端1.5cm处，用超纯水或者异丙醇液封，凝胶半小时以上；

　　(2)弃去分离胶上的超纯水或异丙醇，以交联度为4.7％的聚丙烯酰胺母液配制浓缩胶浓度7.5％，ph4.2丙烯酰胺浓缩胶，插入长城齿梳子，凝胶半小时以上；

　　(3)用乳酸铝电极缓冲液在150v恒压电泳50min，前沿指示剂到达分离胶后变换电压为200v，恒压电泳2.5h。通过上述条件可以使过氧化物酶在浓缩胶中得到较好浓缩，进一步在分离胶中实现良好分离。

　　综上所述，本发明的优点及积极效果为：采用酸性聚丙烯酰胺电泳分离木兰科植物过氧化物酶，改变了传统聚丙烯酰胺电泳分离过氧化物酶同工酶方法分辨率不高、同工酶显现条带数少，所获同工酶位点信息量少等缺点。所采用的方法可以使木兰科植物中过氧化物酶同工酶条带得到最大程度呈现，可以比较完整揭示该酶的信息，为进一步研究木兰科植物的分类、进化以及亲缘关系提供了良好的基础。

　　为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

　　本发明提供一种利用聚丙烯酰胺酸性电泳分离过氧化物酶的方法，方便快捷、准确有效，适用于实际生产应用。

　　如图1所示，本发明实施例提供的木兰科植物过氧化物酶的酸性聚丙烯酰胺电泳分离方法包括以下步骤：

　　s103：采用联苯胺法快速显色，显色完成后，选择epson扫描仪中的透射稿模式快速扫描染色后的凝胶，防止条带扩散。

　　在本发明的优选实施例中：步骤s101具体包括：首先将新鲜采摘的木兰科植物叶片，用自来水洗净后，再用超纯水漂洗三次，最后用干净的吸水纸或脱脂棉将水吸干(切记不可用烘干、晒干等加热使水分蒸发的方法)。采用冰浴研磨的方法提取叶片中的过氧化物酶，具体步骤如下：先将洗净擦干的木兰科植物叶片用剪刀剪碎，并在分析天平上称重，按1:5(叶鲜重：提取液体积)比例加入50mmol/lph6.0乙酸盐缓冲提取液，冰浴研磨(可添加适量二氧化硅辅助研磨)，随后在4℃10000g条件下离心10min，所得上清液按照10：1比例加入上样缓冲液(loadingbuffer)，该缓冲液含0.05％甲基绿的50mmol/lph6.0乙酸盐，贮存4℃冰箱备用。

　　a、采用北京六一仪器厂生产的循环水冷却电泳仪进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，压条封边后，将在4℃冰箱冷却的以交联度为4.7％的聚丙烯酰胺母液配制分离胶浓度7.5％，ph3.1丙烯酰胺分离胶，灌注至梳子下端1.5cm处，立即用超纯水或者异丙醇液封，凝胶半小时以上。

　　b、弃去分离胶上的超纯水或异丙醇，以交联度为4.7％的聚丙烯酰胺母液配制浓缩胶浓度7.5％，ph4.2丙烯酰胺浓缩胶(含20％蔗糖)，插入长城齿梳子，凝胶半小时以上。

　　c、用乳酸铝电极缓冲液(含0.25％乳酸铝，0.72％乳酸，ph3.1)在150v(10v/cm)恒压电泳约50min，前沿指示剂到达分离胶后变换电压为200v，恒压电泳2.5h(约2h前沿指示剂到达底部，再电泳0.5h使条带分离度提高)。

　　a、在分析天平上准确称取洗净擦干剪碎的厚朴叶0.5g，加入2.5ml50mmol/lph6.0的乙酸盐缓冲提取液，于冰上研磨至匀浆后转至5ml离心管中，在4℃10000g条件下离心10min，收集上清液。

　　b、取0.5ml上述上清液于2ml试管中，向其中加入0.05ml上样缓冲液，混匀后4℃10000g条件下离心10min，收集上清液，贮存于4℃冰箱备用。

　　a、丙烯酰胺贮液：称取30gacr和1.5gbis，加水溶解后定容至100ml，避光保存于4℃冰箱。

　　b、0.5％feso4：称取0.5gfeso4加入至预先煮沸并加入稀硫酸的少量水中溶解完全后，加水定容至100ml。

　　c、2％抗坏血酸：分别取0.2gvc、0.01gedta、0.02ml冰乙酸于20ml烧杯中，用少量水溶解后，定容至10ml；用棕色小试管分装，可于4℃冰箱保存2个月。

　　g、电极缓冲液：称取5g乳酸铝于1000ml烧杯中少量水溶解后，加水至800ml后用乳酸调节ph至3.1，定容至1000ml。

　　h、联苯胺染色液：称取0.5g联苯胺先于25ml无水乙醇中溶解后再加入50ml1.5mol/l三水乙酸钠和50ml1.5mol/l乙酸定容至500ml，用前加入5～6滴h2o2。

　　i、ph3.12.5％乳酸铝：称取2.5g乳酸铝加少量水溶解后，加水至80ml，用乳酸调节ph至3.1后，定容至100ml。

　　j、ph4.21.5％乳酸铝：称取1.5g乳酸铝加少量水溶解后，加水至80ml，用乳酸调节ph至4.2后，定容至100ml。

　　a、采用北京六一仪器厂生产的循环水冷却电泳仪进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，压条封边后，将在4℃冰箱冷却的以交联度为4.7％的聚丙烯酰胺母液配制的分离胶浓度7.5％，ph3.1丙烯酰胺分离胶，灌注至梳子下端1.5cm处，立即用超纯水或者异丙醇液封，凝胶半小时以上。

　　b、弃去分离胶上的超纯水或异丙醇，以交联度为4.7％的聚丙烯酰胺母液配制的浓缩胶浓度7.5％，ph4.2丙烯酰胺浓缩胶(含20％蔗糖)，插入长城齿梳子，凝胶半小时以上。

　　d、用乳酸铝电极缓冲液(含0.25％乳酸铝，0.72％乳酸，ph3.1)在150v(10v/cm)恒压电泳约50min，前沿指示剂到达分离胶后变换电压为200v，恒压电泳2.5h(约2h前沿指示剂到达底部，再电泳0.5h使条带分离度提高)。

　　采用联苯胺法快速显色，显色完成后，选择epson扫描仪中的透射稿模式快速扫描染色后的凝胶，防止条带扩散。(如图3b)

　　注：a、b方法参照郭尧君《蛋白质电泳实验技术·第二版》，c方法参照w.bushuk方法改进。

　　以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。