最近，CRISPR基因编辑领域迎来里程碑时刻，美国FDA批准了CRISPR-Cas9基因编辑疗法 Casgevy 上市，用于治疗镰状细胞病（SCD）和β-地中海贫血（TDT）。该疗法的获批，为基于更高效、更精确的下一代基因组编辑器的临床应用能够铺平了道路。许多基于CRISPR-Cas9的疗法正在进行临床试验，用于治疗包括遗传疾病和癌症在内的多种疾病。

　　CRISPR-Cas9开创了基因编辑新时代，但其局限性也非常明显，例如，其依赖于DNA双链断裂（DSB），具有多种潜在风险，此外，大约58%的遗传疾病由单碱基突变所致，CRISPR-Cas9难以发挥作用。

　　刘如谦（David Liu）等人自2016年以来开发并逐步完善的碱基编辑（base editing）技术，其能够在特定位点以高精度和高效率对单个碱基对进行编辑，且不依赖DNA双链断裂（DSB），被认为相比于CRISPR-Cas9具有更高的安全性，也被称为CRISPR 2.0。目前，已有多项基于碱基编辑的基因编辑疗法进入临床试验，并在罕见遗传病和癌症等疾病中展示了有潜力的治疗效果。

　　但实际上，碱基编辑会以Cas依赖和Cas非依赖的方式在DNA及RNA水平产生大量脱靶编辑，尤其是胞嘧啶碱基编辑器CBE（C-to-T），以及在CBE基础上开发的碱基颠换编辑器CGBE（C-to-G）。然而，CGBE由于编辑副产物多，导致相关应用仍然不多，而大约有10%的单碱基突变需要使用CGBE进行修正。因此，评估现有CGBE的编辑效果，以及开发更安全有效的CGBE编辑器具有重要的基础研究和临床应用的意义。

　　该研究发现并证实了CGBE碱基编辑器在编辑过程中会导致意想不到的DNA双链断裂（DSB）损伤，细胞对这些DSB的错误连接修复会导致片段插入/缺失突变、甚至染色体易位等副产物的产生，这提示了我们，碱基编辑也可能增加基因组不稳定性，将其应用于临床治疗具有极大潜在风险。

　　该研究还对CGBE的各种编辑产物及副产物的发生机制的深入分析，通过引入DNA损伤修复因子，开发了副产物更少、更安全的新型CGBE碱基编辑器。

　　研究团队首先通过深度测序，检测了几种现有的可以实现C-to-G碱基颠换编辑的CGBE编辑器的编辑产物，发现与CBE编辑器相比，它们在提高C-to-G颠换编辑概率的同时，片段缺失、插入突变等副产物的产生也明显增多，并且这些副产物的发生位点与靶向编辑的突变位点以及Cas9-nickase组分的切割位点密切相关。

　　随后，研究团队通过END-seq技术检测碱基编辑细胞中产生的未连接的、持续存在的DNA双链断裂（DSB）末端，发现CGBE产生的DSB末端虽然少于野生型Cas9，但是相较于Cas9-nickase，仍产生了显著增多的DSB末端。

　　接下来，研究团队利用改进的染色体易位检测技术Tn5-HTGTS，在CGBE编辑的细胞中检测到了显著增加的染色体易位连接产物，这说明CGBE在碱基编辑的过程中导致了基因组不稳定性的增加，因此，今后将其应用于临床治疗具有极大潜在风险。

　　为了获得优化现有CGBE的线索，研究团队通过CRISPR-Screening技术，筛选了影响CGBE不同产物产生的DNA损伤应答因子。结果显示，现有的CGBE通过引入糖苷酶UNG的方式，增加胞嘧啶脱氨产物U的切除，导致更多脱碱基位点（AP位点）的产生，细胞内APE酶识别并切割AP位点导致Cas9-nickase非靶向的DNA链断裂，联合CGBE组分Cas9-nickase在靶向链上对DNA链的切割，共同导致了CGBE编辑过程中的DNA双链断裂（DSB）损伤的增加。细胞内的非同源末端连接修复通路（NHEJ）因子识别和处理这些DSB的过程中，容易导致片段缺失、插入突变的形成。此外，研究团队还筛选到了NHEJ因子以及跨损伤修复通路（TLS）因子在C-to-G颠换编辑的产生中发挥作用，为进一步构建C-to-G频率更高的CGBE提供了线索。

　　最后，研究团队利用AP位点保护蛋白HMCES，通过融合表达经过蛋白质定向进化的HMCES蛋白、或者将其与CGBE共表达的方式，抑制APE酶对AP位点的切割，在不影响C-to-G碱基颠换编辑频率的情况下，构建了从源头减少DNA双链断裂（DSB），进而抑制DSB引起的多种副产物的新型C-to-G碱基颠换编辑器。

　　总的来说，这项研究发现并证实了CGBE碱基编辑器在碱基编辑过程中会产生大量DNA双链断裂（DSB），而细胞对DSB的错误修复连接进一步导致多种编辑副产物的产生。通过研究副产物的具体发生机制，引入DNA损伤修复因子，该研究最终构建了减少DSB及DSB引起的各类副产物的新型CGBE碱基编辑器。

　　该研究由国科大杭州高等研究院-中国科学院上海分子细胞卓越创新中心孟飞龙研究组和上海交通大学医学院上海市免疫学研究所叶菱秀研究组合作完成，国科大杭高院孟飞龙组的博士后黄敏、尚雅芳，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心孟飞龙研究组博士研究生秦艺宁为该论文的共同第一作者，孟飞龙和叶菱秀研究员为该论文的共同通讯作者，该研究还得到了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心吴薇研究员、复旦大学附属肿瘤医院孙艺华教授、上海交通大学医学院生物化学与分子细胞生物学系徐颖洁教授、医学院郑小琪教授、上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院王剑教授和中山大学医学院董俊超教授的大力支持。

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